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生物實(shí)驗(yàn)室利用液氮罐進(jìn)行大鼠肝S9的制備和蛋白含量的精確測定

時間:2020-03-30 09:06來源: 作者:班德液氮罐 點(diǎn)擊:
1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br /> 學(xué)會大鼠肝S9的制備及其蛋白含量的測定。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
2.1實(shí)驗(yàn)動物
大鼠:健康、雄性、成年,SD或Wistar ,5~6 周 齡,150g左右
2.2試劑
1.17% (0.15M) KCl、苯巴比妥鈉、戊巴比妥鈉、多氯聯(lián)苯、β-萘黃酮    
Tris-HCl緩沖液:6.05g Tris加約800ml蒸餾水溶解,用HCl溶液調(diào)pH值至7.4,最后用蒸餾水定容至1000ml
2.3器材
低溫高速離心機(jī)、潔凈工作臺、勻漿器、注射器、手術(shù)剪、低溫冰箱、液氮罐
2.4 實(shí)驗(yàn)操作
2.4.1試劑的配制
(1)Tris-HCl緩沖液:6.05g Tris加約80ml蒸餾水溶解,用HCl溶液調(diào)pH值至7.4,最后用蒸餾水定容至1000ml
(2)考馬斯亮蘭G-250染料:稱100mg考馬斯亮蘭G-250,溶于50ml 95%的乙醇后,再加入120ml 85%的磷酸,用蒸餾水稀釋至1升,濾紙過濾。
2.4.2肝S9的制備
(1)誘導(dǎo)   苯巴比妥鈉80mg/kg, 腹腔注射,連續(xù)3~5d,最后一次給藥后24h后采樣。
(2)采樣   采樣前禁食24h,但可以自由飲水;斷頭處死;無菌取出肝臟,置平皿中稱重,用預(yù)冷的0.15M  KCl溶液淋洗數(shù)次,以便除去能抑制微粒體酶活性的血紅蛋白。
(3)肝勻漿的制備   棄去淋洗液,將肝臟轉(zhuǎn)入小燒杯,加 Tris-HCl緩沖液溶液     3mL/g (肝濕重),轉(zhuǎn)入冰浴,用剪刀剪碎肝臟,轉(zhuǎn)入勻漿器勻漿。
(4)制備S9    將肝勻漿于低溫高速離心機(jī)0~4℃ 000g  離心  10min上清液即為S9。
(5)分裝保存   將制備好的S9于無菌冷凍管或安瓿中保存,每個安瓿2mL左右。于液氮罐速凍后置-80℃低溫保存。深低溫或冰凍干燥,保存期不超過一年。

2.5蛋白含量測定(考馬斯亮蘭染色法)
2.5.1測定原理
 考馬斯亮蘭G-250染料,在酸性溶液中與蛋白質(zhì)(主要是堿性氨基酸,特別是精氨酸和芳香族氨基酸殘基)結(jié)合,使染料的**吸收峰的位置,由465nm變?yōu)?95nm,溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。染料在595nm下測定的吸光度值與蛋白質(zhì)濃度成正比。
2.5.2特點(diǎn)
(1)靈敏度高,比Lowry法約高四倍,其最低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá)0.5 mg
(2)測定快速、簡便,只需加一種試劑。完成一個樣品的測定,只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程,大約只要2分鐘即可完成,其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定,且在5分鐘至20分鐘之間,顏色的穩(wěn)定性**。
(3)干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。
2.5.3試劑與器材
試劑:
標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:1mg/ml牛血清清蛋白(BSA)
考馬斯亮蘭G-250染料試劑:稱100mg考馬斯亮蘭G-250,溶于50ml 95%的乙醇后,再加入120ml 85%的磷酸,用蒸餾水稀釋至1升,濾紙過濾。
Tris-HCl緩沖液: 6.05g Tris加約80ml蒸餾水溶解,用HCl溶液調(diào)pH值至7.4,最后用蒸餾水定容至1000ml(0.05M)
2.5.4操作方法
微量法制定標(biāo)準(zhǔn)曲線
按下表加樣,混勻,室溫靜置5-10min,以0號試管為空白對照,于595nm處比色測定吸光度,平行測定三次。95nm處吸光度為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表一:測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的試樣
樣品編號    0    1    2    3    4    5    6
標(biāo)準(zhǔn)血清溶液(ug)
標(biāo)準(zhǔn)血清溶液(ml)
蒸餾水(ml)    0
0
0.1    10
0.01
0.09    20
0.02
0.08    40
0.04
0.06    60
0.06
0.04    80
0.08
0.02    90
0.1
0
考馬斯亮蘭試劑(ml)    5.0

肝S9蛋白質(zhì)濃度的測定
測定方法同上,分別取肝S9組分10倍稀釋液20mL、30mL、40mL,按下表加樣,測595nm的吸光度值,平行測定三次。根據(jù)所測定的平均值,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量,從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)。


表二:待測蛋白的試樣
樣品編號    0    1    2    3
上清液(ml)
蒸餾水(ml)    0
0.1    0.02
0.08    0.03
0.07    0.04
0.06
考馬斯亮蘭試劑(ml)                   5.0





3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表三:準(zhǔn)曲線管的吸光度值
試樣    1          2         3         4           5         6  
一    0.012    0.087      0.209     0.330      0.465      0.630
二    0.062    0.084      0.245     0.360      0.472      0.600
三    0.085    0.100      0.258     0.380      0.445      0.620
平均值    0.053    0.090      0.237     0.357      0.461      0.617

圖一:蛋白質(zhì)濃度和吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
 

 表四: 稀釋液樣品吸光度值
試樣    1                2            3       
一    0.255    0.439        0.520   
二    0.208    0.280        0.466   
三    0.195    0.435        0.690   
平均值    0.220    0.385        0.559  

利用軟件讀出稀釋液樣品的蛋白分別為0.038、0.066、0.095。
算出三次取樣的上清液濃度分別為19 mg/ml、22 mg/ml、24 mg/ml,取平均值得蛋白質(zhì)的濃度為21.7 mg/ml。液氮罐


4討論
肝臟微粒體中含有多種酶系統(tǒng),是許多藥物、殺蟲劑、除草劑、污染物及食物添加劑等外源性高脂溶性物質(zhì)在體內(nèi)的主要生物轉(zhuǎn)化場所,也稱為肝微粒體藥物代謝酶,簡稱為肝藥酶。該酶系統(tǒng)底物面廣,活性個體差異大,影響活性因素多。其中最重要的是混合功能氧化酶系統(tǒng),可催化許多不同型的氧化反應(yīng),如羥基化,烷基化,脫氨基化,脫鹵素,硫原子氧化等。該酶系統(tǒng)中一個主要成分是細(xì)胞色素P450,是由與一氧化碳結(jié)合后,在光譜450nm處有吸收峰而得名。細(xì)胞色素P450含量高低反映了混合功能氧化酶系統(tǒng)活性的高低,這個系統(tǒng)將分子氧中一個氧原子氧化藥物,另一個氧原子生成水,沒有產(chǎn)生相應(yīng)的還原物,故也稱為細(xì)胞色素單加氧酶。肝S9主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,是一個酶系統(tǒng)。
    肝微粒體酶的制備需在無菌條件下操作,制備之后要用液氮速凍后置-80℃低溫保存。凍干法是生物化學(xué)、生物制劑和微生學(xué)用以保持某些蛋白質(zhì)、酶類和原核生物活性的較好方法之一。保持肝的代謝活性, 實(shí)質(zhì)上就是要保持肝內(nèi)微粒體膜上的酶類的活性。因此, 用凍干法保持肝的代謝活性。本次實(shí)驗(yàn)過程肝S9制備好以后直接用于測定因此沒有進(jìn)行凍干儲存的步驟。
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