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淋巴細胞雜交瘤單克隆抗體技術

時間:2020-03-08 09:53來源: 作者:班德液氮罐 點擊:
淋巴細胞雜交瘤單克隆抗體技術 液氮罐

  1975年,Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細胞和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合,形成的雜交細胞既可產(chǎn)生抗體,又可無限增殖,從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術。這一技術上的突破不僅為醫(yī)學與生物學基礎研究開創(chuàng)了新紀元,也為臨床疾病的診、防、治提供了新的工具。

  制備單克隆抗體包括動物免疫、細胞融合、選擇雜交瘤、檢測抗體、雜交瘤細胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn),要經(jīng)過幾個月的一系列實驗步驟,下面按照制備單克隆抗體的流程順序,逐一介紹其實驗方法。

  一、細胞融合前準備

  (一) 免疫方案

  選擇合適的免疫方案對于細胞融合雜交的成功,獲得高質量的McAb至關重要。一般要在融合前兩個月左右確立免疫方案開始初次免疫,免疫方案應根據(jù)抗原的特性不同而定。

  1. 顆粒性抗原免疫性較強,不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細胞性抗原為例的免疫方案:

  初次免疫       1×107/0.5ml ip (腹腔內注射)

  ↓ 2~3周后

  第二次免疫      1×107/0.5ml ip

  ↓ 3周后

  加強免疫(融合前三天) 1×107/0.5ml ip或iv(靜脈內注射)

  ↓

  取脾融合

  2. 可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐劑,常用佐劑:福氏完全佐劑,福氏不完全佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起,研磨成油包水的乳糜狀,放一滴在水面上不易馬上擴散呈小滴狀表明已達到油包水的狀態(tài)。商品化福氏完全佐劑在使用前須振搖,使沉淀的分枝桿菌充分混勻。

  初次免疫  Ag 1~50μg 加福氏完全佐劑皮下多點注射

  │     (一般0.8~1ml 0.2ml/點)

  ↓3周后

  第二次免疫 劑量同上,加福氏不完全佐劑皮下或ip

  │       (ip劑量不宜超過0.5ml)

  ↓3周后

  第三次免疫 劑量同上,不加佐劑,ip

  │ (5~7天后采血測其效價,檢測免疫效果)

  ↓2~3周后

  加強免疫,劑量50~500μg為宜,ip或iv

  ↓3天后

  取脾融合

  目前,用于可溶性抗原(特別是一些弱抗原)的免疫方案也不斷有所更新,如①將可溶性抗原顆?;蚬滔嗷?,一方面增強了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑,基礎免疫可直接采用脾內注射。③使用細胞因子作為佐劑,提高機體的免疫應答水平,促進免疫細胞對抗原反應性。液氮罐

  (二) 飼養(yǎng)細胞

  在制備單克隆抗體過程中,許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細胞,如:在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養(yǎng)過程中,加入飼養(yǎng)細胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細胞有:小鼠腹腔巨噬細胞(較為常用)、小鼠脾臟細胞或小鼠胸腺細胞,也有人用小鼠成纖維細胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細胞,使用比較方便,照射后可放入液氮罐長期保存,隨用隨復蘇。

  小鼠腹腔巨噬細胞的制備

  小鼠采用與免疫小鼠相同的品系,常用BaLb/c小鼠6~10周齡

  ↓

  拉頸處死 浸泡于75%酒精,消毒3~5分鐘

  ↓

  用無菌剪刀剪開皮膚,暴露腹膜

  ↓

  用無菌注射器注入6~8ml培養(yǎng)液

  ↓

  反復沖洗,吸出沖洗液

  ↓

  放入10ml離心管,1200轉/分離心5~6分鐘

  ↓

  用20%小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)液混懸,調整細胞數(shù)1×105/ml

  ↓

  加入96孔板,100μl/孔

  ↓

  放入37℃ CO2孵箱培養(yǎng)

  一般飼養(yǎng)細胞在融合前一天制備,一只小鼠可獲得5~8×106腹腔巨噬細胞,若用小鼠胸腺細胞作為飼養(yǎng)細胞時,細胞濃度為5×106/ml,小鼠脾細胞為1×106/ml,小鼠的成纖維細胞(3T3)1×105/ml,均為100μl/孔。

  (三) 骨髓瘤細胞

  骨髓瘤細胞系應和免疫動物屬于同一品系,這樣雜交融合率高,也便于接種雜交瘤細胞在同一品系小鼠腹腔內產(chǎn)生大量 McAb。

  常用骨髓瘤細胞系有:NS1、SP2/0、X63 Ag8.653等。

  骨髓瘤細胞的培養(yǎng)適合于一般的培養(yǎng)液,如RPMI1640,DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10~20%,細胞的**密度不得超106/ml,一般擴大培養(yǎng)以1∶10稀釋傳代,每3~5天傳代一次。細胞的倍增時間為16~20小時,上述三株骨髓瘤細胞系均為懸浮或輕微貼壁生長,只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細胞。

  一般在準備融合前的兩周就應開始復蘇骨髓瘤細胞,為確保該細胞對HAT的敏感性,每3~6月應用8~AG(8氮雜鳥嘌呤)篩選一次,以防止細胞的突變。

  保證骨髓瘤細胞處于對數(shù)生長期,良好的形態(tài),活細胞計數(shù)高于95%,也是決定細胞融合的關鍵。

  (四) 免疫脾細胞

  免疫脾細胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細胞棗漿母細胞。一般取最后一次加強免疫3天以后的脾臟,制備成細胞懸液,由于此時B淋巴母細胞比例較大,融合的成功率較高。

  脾細胞懸液的制備:在無菌條件下取出脾臟,用不完全的培養(yǎng)液洗一次,置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上,用注射器針芯研磨成細胞懸液后計數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的2倍,細胞數(shù)為2×108左右。液氮罐

  二、細胞融合,選擇雜交瘤

  (一) 細胞融合流程

  (1) 取對數(shù)生長的骨髓瘤細胞SP2/0,1000rpm離心5分鐘,棄上清,用不完全培養(yǎng)液混懸細胞后計數(shù),取所需的細胞數(shù),用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。

  (2) 同時制備免疫脾細胞懸液,用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。

  (3) 將骨髓瘤細胞與脾細胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起,在50ml塑料離心管內用不完全培養(yǎng)液洗1次,1200rpm,8分鐘。

  (4) 棄上清,用滴管吸凈殘留液體,以免影響PEG的濃度。

  (5) 輕輕彈擊離心管底,使細胞沉淀略加松動。

  (6) 在室溫下融合:

  ① 30秒內加入預熱的1ml45%PEG(Merek,分子量4000)含5%DMSO,邊加邊攪拌。

 ?、凇∽饔?0秒鐘,若冬天室溫較低時可延長至120秒鐘。

 ?、邸〖宇A熱的不完全培養(yǎng)液,終止PEG作用,每隔2分鐘分別加入1ml,2ml,3ml,4ml,5ml和10ml。

  (7) 離心,800rpm,6分鐘。

  (8) 棄上清,先用6ml左右20%小牛血清RPMI1640輕輕混懸,切記不能用力吹打,以免使融合在一起的細胞散開。

  (9) 根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量,補加完全培養(yǎng)液,10ml一塊96孔板。

  (10) 將融合后細胞懸液加入含有飼養(yǎng)細胞的96孔板,100μl/孔,37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。

  一般一塊96孔板含有1×107脾細胞。

  (二) HAT選擇雜交瘤

  應用HAT 選擇培養(yǎng)液篩選雜交瘤細胞的原理已在研究生專題講座第六專題中已經(jīng)提到,這里主要介紹加HAT選擇培養(yǎng)的時間和濃度。

  一般在融合24小時后,加HAT選擇培養(yǎng)液。HT和HAT均有商品化試劑50×貯存,用時1ml加入50ml20%小牛血清完全培養(yǎng)液中。

  因為在培養(yǎng)板內已加入飼養(yǎng)細胞、融合后的細胞,200μl/孔。所以在加選擇培養(yǎng)液時應加3倍量的HAT。我們認為,融合后最初補加的量可用全量的2/3進行選擇,可得到滿意的篩選結果。

  50×HAT

  H: 5×10-3M

  A: 2×10-5M

  T: 8×10-4M

  一般選擇HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后,改用HT培養(yǎng)液,再維持培養(yǎng)兩周,改用一般培養(yǎng)液。

  三、抗體的檢測

  篩選雜交瘤細胞通過選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細胞系中,僅少數(shù)能分泌針對免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時,即可開始檢測特異性抗體,篩選出所需要的雜交瘤細胞系。

  檢測抗體的方法應根據(jù)抗原的性質、抗體的類型不同,選擇不同的篩選方法,一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。

  常用的方法有:

  1. ELISA用于可溶性抗原(蛋白質)、細胞和病毒等McAb的檢測。

  2. RIA用于可溶性抗原、細胞McAb的檢測。

  3. FACS(熒光激活細胞分類儀)用于檢查細胞表面抗原的McAb檢測。

  4. IFA用于細胞和病毒McAb的檢測。

  上述方法均為一般實驗室的常規(guī)方法,故在此不介紹具體的實驗過程。

  可靠的篩選方法必須在融合前建立,避免由于方法不當貽誤整個篩選時機。

  四、雜交瘤的克隆化和凍存

  克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。犚r為經(jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內只有一個克隆。在實際工作中,可能會有數(shù)個甚至更多的克隆,可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞;所需要的抗體(特異性抗體)分泌細胞和其它無關抗體分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開,就需要克隆化??寺』脑瓌t是,對于檢測抗體陽性的雜交克隆應盡早進行克隆化,否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制,因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快,二者競爭的結果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆,以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失,從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。

  (一) 克隆化方案

  用克隆化的方法很多,而最常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。

  1. 有限稀釋法的程序

 ?、佟≈苽滹曫B(yǎng)細胞懸液(同融合前準備)

  ② 陽性孔細胞的計數(shù),并調細胞數(shù)在1~5×103/ml

  ③ 取130個細胞放入6.5ml含飼養(yǎng)細胞完全培養(yǎng)液,即20個細胞/ml,100μl/孔加A、B、C三排為每孔2個細胞。余下2.9ml細胞懸液補加2.9ml含飼養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)液,細胞數(shù)為10個/ml,100μl/孔加D、E、F三排,為每孔1個細胞。余下2.2ml細胞懸液補加2.2ml 含飼養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)液,細胞數(shù)5個/ml,100μl/孔,加G、H兩排,為每孔0.5個細胞。

 ?、堋∨囵B(yǎng)4~5天后,在倒置顯微鏡上可見到小的細胞克隆,補加完全培養(yǎng)液200μl/孔。

 ?、荨〉?~9天時,肉眼可見細胞克隆,及時進行抗體檢測。

  注:初次克隆化的雜交瘤細胞需要在完全培養(yǎng)液中加HT。

  2. 軟瓊脂法

  ① 軟瓊脂的配制

  含20%FCS(小牛血清)的2倍濃縮的RPMI1640

  1%瓊脂水溶液:高壓滅菌,42℃預熱。

  0.5%瓊脂:由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。

 ?、凇∮蒙鲜?.5%瓊脂液(含有飼養(yǎng)細胞)15ml傾注于直徑為9cm的平皿中,在室溫中待凝固后作為基底層備用。

 ?、邸“?00/ml,500/ml或5000/ml等濃度配制需克隆的細胞懸液。

 ?、堋?ml 0.5%瓊脂液(42℃預熱)在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合。

 ?、荨』靹蚝罅⒓磧A注于瓊脂基底層上,在室溫中10分鐘,使其凝固,孵育于37℃,5%CO2孵箱中。

 ?、蕖?~5天后即可見針尖大小白色克隆,7~10天后,直接移種至含飼養(yǎng)細胞的24孔板中進行培養(yǎng)。

 ?、摺z測抗體,擴大培養(yǎng),必要時再克隆化。

  (二) 雜交瘤細胞的凍存

  及時凍存原始孔的雜交瘤細胞、每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩(wěn)定分泌抗體的細胞系的時候,細胞的培養(yǎng)過程中隨時可能發(fā)生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存,則因為上述的意外而全功盡棄。

  雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣,原則上細胞應在每支安瓿含1×106以上,但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變,在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),當長滿孔底時,一孔就可以凍一支安瓿。

  細胞凍存液:

  50%小牛血清

  40%不完全培養(yǎng)液

  10% DMSO(二甲亞砜)

  凍存液**預冷,操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降到0℃,再降溫時一般按每分鐘降溫2~3℃,待降至-70℃可放入液氮中?;蚣毎芙抵?0℃ 后放-70℃超低溫冰箱,次日轉入液氮中。也可以用細胞凍存裝置進行凍存。凍存細胞要定期復蘇,檢查細胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性,在液氮中細胞可保存數(shù)年或更長時間。

  五、單克隆抗體的大量生產(chǎn)

  大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種:

  1. 體外使用旋轉培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細胞,從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低,一般培養(yǎng)液含量為10~60μg/ml,如果大量生產(chǎn),費用較高。

  2. 體內接種雜交瘤細胞,制備腹水或血清。

  ① 實體瘤法 對數(shù)生長期的雜交瘤細胞按1~3×107/ml接種于小鼠背部皮下,每處注射0.2 ml, 共2~4點。待腫瘤達到一定大小后(一般10~20天)則可采血,從血清中獲得單克隆抗體含量可達到1-10mg/ml。但采血量有限。

 ?、凇「顾闹苽洹〕R?guī)是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液體石臘于BaLb/c鼠,1~2周后腹腔注射1×106個雜交瘤細胞,接種細胞7~10天后可產(chǎn)生腹水,密切觀察動物的健康狀況與腹水征象,待腹水盡可能多,而小鼠頻于死亡之前,處死小鼠,用滴管將腹水吸入試管中,一般一只小鼠可獲1~10ml腹水。也可用注射器抽取腹水,可反復收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達5-20mg/ml, 這是目前最常用的方法,還可將腹水中細胞凍存起來,復蘇后轉種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。

  六、單克隆抗體的鑒定

  對制備的McAb進行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的。應對其做如下方面的鑒定:

  1. 抗體特異性的鑒定:除用免疫原(抗原)進行抗體的檢測外,還應用與其抗原成分相關的其它抗原進行交叉試驗,方法可用ELISA、IFA法。例如① 制備抗黑色素瘤細胞的McAb,除用黑色素瘤細胞反應外,還應用其它臟器的腫瘤細胞和正常細胞進行交叉反應,以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關抗原的單克隆抗體。② 制備抗重組的細胞因子的單克隆抗體,應首先考慮是否與表達菌株的蛋白有交叉反應,其次是與其它細胞因子間有無交叉。

  2. McAb的Ig類與亞類的鑒定:一般在用酶標或熒光素標記的第二抗體進行篩選時,已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標或熒光素標記的兔抗鼠IgG或IgM,則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標準抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴或夾心ELISA來確定McAb的亞類。在作雙擴試驗時,如加入適量的PEG(3%),將有利于沉淀線的形成。

  3. McAb中和活性的鑒定:用動物的或細胞的保護實驗來確定McAb的生物學活性。例如如果確定抗病毒McAb的中和活性,則可用抗體和病毒同時接種于易感的動物或敏感的細胞,來觀察動物或細胞是否得到抗體的保護。

  4. McAb識別抗原表位的鑒定:用競爭結合試驗、測相加指數(shù)的方法,測定McAb所識別抗原位點,來確定McAb的識別的表位是否相同。

  5. McAb親和力的鑒定:用ELISA或RIA競爭結合試驗來確定McAb與相應抗原結合的親和力。

  七、影響因素、失敗原因分析

  由于制備McAb的實驗周期長,環(huán)節(jié)多,所以影響因素就比較多,稍不注意就會造成失敗。

  其主要失敗原因和影響因素有:

  1. 污染:包括細菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中最辣手的問題。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應及早將污染板棄之,以免污染整個培養(yǎng)環(huán)境。支原體的污染主要來源于牛血清,此外,其它添加劑、實驗室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。在有條件的實驗室,要對每一批小牛血清和長期傳代培養(yǎng)的細胞系進行支原體的檢查,查出污染源應及時采取措施處理。對于污染的雜交瘤細胞可以采取生物學的過濾方法,將污染的雜交瘤細胞注射于BALB/c小鼠的腹腔,待長出腹水或實體瘤時,犖^菌取出分離雜交瘤細胞,一般可除去支原體污染。

  2. 融合后雜交瘤不生長:在保證融合技術沒有問題的前提下主要考慮下列因素①PEG有毒性或作用時間過長。②牛血清的質量太差,用前沒有進行嚴格的篩選。③骨髓瘤細胞污染了支原體。④HAT有問題,主要是A含量過高或HT含量不足。

  3. 雜交瘤細胞不分泌抗體或停止分泌抗體

 ?、佟∪诤虾笥屑毎L,但無抗體產(chǎn)生,可能是HAT中A失效或骨髓瘤細胞發(fā)生突變,變成A抵抗細胞所致。

 ?、凇∮锌赡苁敲庖咴乖匀?,免疫效果不好。

 ?、邸τ谠置诳贵w的雜交瘤細胞變?yōu)殛幮?,可能是細胞支原體污染,或非抗體分泌細胞克隆競爭性生長,從而抑制了抗體分泌細胞的生長。也可能發(fā)生染色體丟失。Goding91982)曾提出“三要”“三不要”,可能是防止抗體停止分泌的有效措施。

  三要:

  要大量保持和補充液氮凍存的細胞原管。

  要應用倒置顯微鏡經(jīng)常檢查細胞的生長狀況。

  要定期進行再克隆。

  三不要:

  不要讓細胞“過度生長”。因為非分泌的雜交瘤細胞將成為優(yōu)勢,壓倒分泌抗體的雜交瘤細胞。

  不要讓培養(yǎng)物不加檢查地任其連續(xù)培養(yǎng)幾周或幾個月。

  不要不經(jīng)克隆化而使雜交瘤在機體內以腫瘤生長形式連續(xù)傳好幾代。

  4. 雜交瘤細胞難以克隆化 液氮罐

  可能與小牛血清質量、雜交瘤細胞的活性狀態(tài)有關,或由于細胞有支原體污染,使克隆化難以成功。若是融合后的早期克隆化,應在培養(yǎng)液加HT。
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